velzevul (dubva1) wrote,
velzevul
dubva1

Генетики не ожидают милостей от природы

Статьи о достижениях биотехнологий напоминают военные репортажи: стреляют генные пушки, используются вирусные и бактериальные средства доставки, а в штабах занимаются чтением шифровок – текстов, написанных четырех- и двадцатибуквенными алфавитами.





Шифровка из штаба


Представьте для себя ленту километровой длины, покрытую вот таким текстом: ATGACCCCCGATCA GAGCG, – при этом непонятно, справа влево его нужно читать либо напротив. Если вспомнить, что обозначают эти буковкы основания ДНК – аденин, тимин, гуанин и цитозин, – станет понятнее, но ненамного. Последующий шаг – деление текста на слова из 3-х букв.


В молекуле ДНК 64 вероятные трехзначные композиции из 4 нуклеотидных оснований кодируют 20 аминокислот, из которых состоят все имеющиеся на этой планетке белки. Переводчиком в клеточке служит матричная рибонуклеиновая кислота – мРНК. Ее алфавит тоже состоит из 4 букв. От языка ДНК он отличается одной буковкой: копируя последовательность нуклеотидов, РНК-полимераза подменяет тимин на урацил (U). Не считая того, буковкы РНК малость отличаются по «шрифту»: заместо дезоксирибозы в состав ее нуклеотидов заходит рибоза.


Переписывание отдельных фраз – генов – из текста ДНК в текст РНК так и именуется – транскрипция. А трансляцией на языке молекулярных биологов именуется перевод с языка нуклеиновых кислот на язык белков из 2-ух 10-ов букв, от A (либо Ala – аланин) до V (либо Val – валин). Аргинин в однобуквенной шифровке обозначается как R, аспарагин – N и т.д., и на всякий случай над столом у тех, кто этим повсевременно занимается, висит табличка со шпаргалкой.


Неважно какая рибосома (хотя заместо 2-ух полушарий у нее есть только две белковые глобулы) знает этот алфавит назубок и, прочитав на цепочке РНК слово «UUG», присоединяет к возрастающей цепочке белка аминокислоту триптофан, AAG либо AAA – лизин, а дойдя до стоп-сигналов – UGA, UAG либо UAA, – кончает синтез. Большая часть аминокислот кодируется несколькими кодонами (от 2-ух до 6). К примеру, команда «присоединяй лейцин» в половине случаев обозначается сочетанием CUG, по 10–20% приходится на CUU, CUC, UUG и UUA, а синоним CUA клеточки употребляют очень изредка.


Чертежи и программки


Если команде инженеров и рабочих дать задание выстроить действующую модель паровоза в истинную величину, они для начала разберут изделие по винтику и издержут массу бумаги на тома технической документации. Работа живой клеточки построена на известном всем программистам принципе открытых исходников – пользуйся, если знаешь как. Перед тем как начать перестраивать живы организмы, генные инженеры должны разобраться с текстом программ, записанных в хромосомах.


Геном бактерии прочесть относительно просто: единственная бактериальная хромосома содержит в среднем около 3-х тыщ генов, и вся информация о работе бактерии записана в нескольких миллионах пар нуклеотидов. Геном хоть какого высшего организма – это млрд пар нуклеотидов, кодирующих 10-ки тыщ генов. К тому же в ДНК микробов сильно мало излишней инфы, а у эукариотических (имеющих клеточное ядро) организмов, даже у одноклеточных дрожжей, ненадобной инфы в геноме больше, чем на жестком диске у самого глухого «чайника». Глупых последовательностей нуклеотидов, псевдогенов (дефектных копий настоящих генов), интронов (участков ничего не кодирующей ДНК снутри генов) и другого мусора в нашей ДНК на порядок больше, чем осмысленной инфы.


Прочесть геном – это только 1-ый шаг работы. После чего нужно выделить из приобретенной последовательности нуклеотидов значащую информацию, осознать, какой белок (либо какую РНК) кодирует каждый ген (либо хотя бы – в каком из генов закодирован подходящий нам белок) и как белки ведут взаимодействие вместе. Введенный в хромосому ген может не заработать по огромному количеству обстоятельств – к примеру, из-за отсутствия в чужом геноме 1-го из 10-ов ферментов, нужных для всех шагов синтеза конечного белка.


Каждый шаг состоит из многих отдельных задач, для выполнения которых необходимо произвести много отдельных операций, для каждой из которых нужно оборудование, от пробирок и чашек Петри до сложных компьютеризированных комплексов, и реактивы – от дистиллированной воды до таких, которые стоят в тыщу раз дороже золота. Когда все есть нужные материалы, инструменты и познания, можно начинать создание чего-нибудь на генном уровне измененного. К примеру, ввести в хромосому мышиной яйцеклетки ген, выделенный из медузы, и наслаждаться мышкой, светящейся в мгле зеленоватым светом.


Инструменты для производства инструментов


Вспомните «Таинственный остров» Жюля Верна. Исходного капитала у команды инженера Сайруса Смита было всего ничего – линза из часовых стекол да железная полоса. Позже, правда, появился инвестор – капитан Немо, который подкинул им дополнительные вложения в виде носовых платков, ружей с боеприпасами и других предметов роскоши, а главное – минимум нужных в хозяйстве инструментов. В итоге робинзоны всего за пару лет прошли путь от каменного века до телеграфа и других передовых достижений тогдашней техники. Но чтоб выстроить чего-нибудть стальное, не считая головы и рук нужны стальная руда и каменный уголь, также чертежи и инструменты, при помощи которых можно сделать станки, а уже на их – сделать нужные для сборки конечного продукта детали.


В биотехнологии каменный век завершился приблизительно посреди XIX столетия от Рождества Христова, когда Луи Пастер обосновал, что предпосылкой брожения являются дрожжи (он открыл еще много чего, но это – главное). Еще около 100 лет в микробиологии, биохимии, генетике, органической химии и других науках происходило скопление критичной массы познаний, которое в 70-х годах ХХ века привело к возникновению современной молекулярной и клеточной биологии. Способы исследования живых объектов и воздействия на их становились все труднее и эффективнее, но то, что происходило в лабораториях, длительно оставалось незапятанной наукой – ученые делали чертежи и инструменты. Разница в том, что для перекройки ДНК употребляют не ножницы и клей, а молекулы ферментов, детали к месту сборки доставляют не вагонетки, а вирусы либо потоки заряженных частиц.


Анализ и синтез


А сейчас вспомните очередной шедевр – «Парк Юрского периода». Если представить, что гены динозавров смогли сохраниться 10-ки миллионов лет – ДНК в капельке крови очень не достаточно для анализа. Но с того времени, как в 1987 году Кэри Муллис изобрел полимеразную цепную реакцию (ПЦР), для исследования ДНК на теоретическом уровне довольно одной молекулы. В учебниках для будущих молекулярных биологов описание ПЦР занимает раза в два больше места, чем вся эта статья – не считая схем на разворот in folio. И это только один из способов, которые используют при анализе и синтезе ДНК.


Что все-таки такое ПЦР? Эталон ДНК помещают в пробирку с ферментом ДНК-полимеразой, консистенцией из всех 4 нуклеотидов и веществом праймеров – синтетических участков из примерно 20 нуклеотидов, комплементарных участкам обратных цепей ДНК на концах размножаемого эталона (если непонятно, что там у него на концах, приходится изворачиваться – к примеру, при помощи способа дегенеративных праймеров). Позже раствор нагревают до 90–95° – двойная нить распадается на одиночные, охлаждают до 50° – праймеры присоединяются к комплементарным участкам, и нагревают до 70° – полимераза, используя праймеры как затравку, достраивает одиночные цепи до двойных. Цикл повторяется, и через 5 минут в растворе будет в 2 раза больше схожих двойных цепочек ДНК, через 10 минут – в 4, через полтора часа, после 20 циклов, – в миллион, а после 30 циклов, через 2,5 часа, – в млрд раз больше, чем в начальном растворе.


Давным-давно, практически 20 годов назад, когда ПЦР-анализ только выдумали, пробирки с ДНК вручную переставляли из одной водяной бани в другую, а после каждого цикла добавляли в их новейшую порцию фермента заместо разложившегося при высочайшей температуре. Но очень скоро просто инженеры выдумали для генных инженеров термоциркуляторы, а микробиологи выделили теплостойкую ДНК-полимеразу из жителя жарких источников – микроорганизма Thermus aquaticus. Совершенно не так давно время процесса удалось уменьшить, заменив тепловое расплетание двойной спирали добавкой фермента хеликазы (от греческого helix – спираль), которая конкретно этим и занимается в ядре клеточки.


Секвенирование – определение последовательности нуклеотидов в ДНК – посреди 1970-х квалифицированный биохимик делал со скоростью несколько сотен нуклеотидов в год. В 2004 году в продажу поступил набор Discovery Kids DNA Explorer для научных работников старше 10 лет. Всего за $79,95 хоть какой молодой натуралист может в течение нескольких часов сделать анализ, на который ровесники его дедушки растрачивали пару лет. А огромные дяди и тети, если у их есть полмиллиона баксов, могут приобрести новый автоматический секвенатор, который расшифровывает 800 000 нуклеотидов в денек, и с умилением вспоминать седоватую древность начала 1990-х, когда приблизительно столько же делали за год тыщи участников программки «Геном человека». А один из способов секвенирования ДНК именуется «выстрел из дробовика». Но к генным пушкам это не имеет никакого дела.


Средства доставки


Генные пушки стреляют золотыми пулями размером от 1 до 4 микрон. Их покрывают частичками ДНК, вставляют в гильзы из капелек воды, заряжают в кассету, похожую на обыденный холостой патрон, и при помощи сжатого воздуха стреляют в чашечку Петри с клеточками. Либо разгоняют водяные брызги электронным полем. Такую стрельбу по площадям используют обычно в случаях, когда клеточки не поддаются более четким способам доставки генов в хромосомы – к примеру, для генетической модификации злаков либо хвойных деревьев.


Бактерии нередко видоизменят при помощи плазмид – соответствующих для бактерий колечек ДНК, на которых хранится несколько генов, несущих информацию, отсутствующую на основном носителе – хромосоме. Для этого из бактериальной клеточки извлекают плазмиды, добавляют в их нужные гены и опять вводят в бактерию.


Являются ли плазмиды прирученными вирусами либо, напротив, вирусы – дикими плазмидами, – такая же неразрешимая загадка, как вопрос о первичности курицы либо яичка. Вирусы употребляют для доставки генов и в плазмиды, и в хромосому микробов. При делении бактерий плазмиды распределяются меж дочерними клеточками случайным образом, и через несколько поколений потомки измененной бактерии могут выродиться в начальную форму либо накопить внутри себя очень много измененных плазмид. А если подходящий исследователям ген ввести в ДНК вируса, который заражает не плазмидную, а хромосомную ДНК, трансформация будет более устойчивой.


Если же обезвреженным ретровирусом с подвешенными к нему генами заразить зародыш, все его клеточки при успешном стечении событий будут нести новый ген. Но грузоподъемность вируса ограничена – менее 8000 пар нуклеотидов. Не исключена и возможность суровых осложнений. К примеру, при лечении томного комбинированного иммунодефицита – единственной наследной заболевания, которую уже начали вылечивать при помощи генной терапии, – в 2 случаях из 12 побочным эффектом оказался рак крови. Потому при разработке трансгенных животных почаще используют способ микроинъекций ДНК.


Опытнейший лаборант за денек может ввести трансгены в несколько сотен мужских пронуклеусов (ядро сперматозоида перед его слиянием с более маленьким ядром яйцеклетки). В наилучшем случае из 5% «прооперированных» яйцеклеток появляются жизнестойкие и несущие подходящий ген животные. Их скрещивают меж собой, и в согласовании с законами Менделя во 2-м поколении у каждого 4-ого животного в хромосомном наборе оказываются две копии нового гена. После скрещивания таких – гомозиготных – животных третье и все следующие поколения будут стопроцентно трансгенными.


А для сотворения на генном уровне измененных растений самой комфортной системой доставки оказались почвенные бактерии – Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes. О том, как и для чего это делают, читайте в последующем номере.






Subscribe

  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

  • 0 comments